Paso 1: Cultivo de células
-Antes de empezar nada, guantes y esterilizar.
-Esterilización es críticamente importante en el proceso de ingeniería de tejidos. Contaminación por elementos químicos o bacterias puede destruir semanas de trabajo y perder todo el dinero puesto en el proyecto. El etanol es su nuevo mejor amigo; gente puede pensar que te has convertido en un alcohólico cuando huelen a tu nuevo amigo en usted todo el tiempo, pero es lo mejor siempre. También no seas muy preocupado cuando viertes bastante mucho todo del laboratorio; se evapora muy rápidamente.
-Una vez estéril, abrir la incubadora que usted ha estado almacenando sus osteoblastos en.
-Que queremos comprobar para la confluencia. Confluencia es hablar de tejido de densidad de población celular.
-Quieres tener > 85% (aproximadamente) confluencia antes pases las células. Que significa que el 85% del campo de visión que puedes ver a través de su microscopio tiene células. Esto es importante estar encima porque las células confluentes no continuará reproduciendo. Es también bueno para crecer tantas células como sea posible porque son un recurso valioso que usted necesite.
-Si, no confluente, usted necesita dar a sus células más tiempo para crecer. Así que esterilizar el frasco, traer al Banco de biohood y limpieza y aspirado de los medios de comunicación fuera de él mientras que siendo consciente de no raspan el fondo del recipiente donde viven las células. Descartar la pipeta. Con una nueva pipeta, llene sólo la parte inferior del matraz con nuevos medios de comunicación.
-Si confluente, necesita las células de paso.
- Esterilizar el frasco y llevarlo a la biohood.
- Aspire los medios sin raspar el fondo del matraz. Deseche la pipeta.
- Lavar las células en PBS por pipetear en la cubeta suficiente PBS para cubrir la parte inferior. Incline suavemente el frasco hacia adelante y hacia atrás.
- PBS de aspirar y descartar la pipeta.
- Pipetee suficiente tripsina en el frasco para cubrir el fondo. Inclinarlo hacia adelante y hacia atrás.
- Esterilizar el frasco e incúbelos durante 2 minutos.
- Aspirar las células y tripsina y colocar en un tubo de centrífuga.
- Centrifugar durante 5 minutos a 1300 rpm (revisión técnica de centrifugación y no olvide el contrapeso).
- Aspire tripsina siendo consciente de no tomar el sedimento celulares. Deseche la pipeta.
- Colocar un volumen conocido de los medios de comunicación en el tubo.
- Aspire de pellet para suspender las células y los medios de comunicación.
- Realizar un recuento celular para comprender su densidad celular por medio de volumen.
- Distribuir las células suspendidas en frascos nuevos.
- Cubrir el fondo de los frascos con los medios de comunicación. Marcar el frasco con la fecha y su nombre. Esterilizar y para incubar.
Se adjunta, es el manual de cultivo celular que utilizamos en clase. Es muy completo y un recurso impresionante.
