Paso 16: Avanzado DIYBio análisis genético: PCR y análisis de Gel
El método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) es una de las más poderosas herramientas en la caja de herramientas de la genetista. PCR es un método enzimático de logarítmico la amplificación de regiones específicas del ADN para su posterior análisis utilizando una serie de calentamiento y enfriamiento de pasos. Pasados los días de pasantes sumergir los frascos de muestras en baños de agua, hoy en día utilizamos a automatizados ciclistas térmicas con un elemento Peltier para ciclo de temperaturas y unos pocos ciudadanos científicos incluso han diseñado versiones DIY para nosotros DIY-biólogos a utilizar.
Por lejos el más fácil termociclador DIY que he visto es la Máquina de genes publicado en Popular Science. Utiliza una bombilla de luz, una especie de enfoque fácil-cueza al horno-horno a un termociclador estándar. Otro DIY termociclador utiliza resistencias en este instructable para la PCR de Arduino. Sin embargo otro utiliza un enfoque similar con una resistencia en el termociclador de la taza de café.
Un equipo de electroforesis de gel puede ser más fácil para el biólogo DIY hacer y ejecutar. Diseña la gama en complejidad desde el relativamente inexperto (mayor énfasis en el relativamente) configuración publicado el hacer a instructables más avanzados para el GellS o el sistema de gel mini. Para correr un gel, aconsejaría utilizando el método descrito en el citado post de hacer pero los usuarios más avanzados pueden seguir el instructivo para la preparación de gel obviamente seguir el protocolo en Open Ware mojado. Por supuesto necesitará comprar o hacer una pipeta para realizar las transferencias de líquido y hacer un transiluminador (como este o este) para verlas.
Por supuesto, para realizar la PCR tendrá que diseñar primers para amplificar la secuencia de interés. Cartillas son simplemente cortas secuencias de ADN monocatenario que son complementarios a las áreas que flanquean la secuencia de interés. Son necesarios para la secuencia de la DNA , así como la más DIY-Bio-friendly PCR específica (SSP) de la secuencia que luego pueden ser distinguidos en un gel. Hay varias empresas a iniciadores de la orden de, buscando en internet para "empresas de síntesis del primer" podrá encontrar uno que enviará a individuos o laboratorios DIY. Secuencia o SSP es importante realizar un PCR inicial para ampliar y enriquecer su región de destino, algunos consejos para una exitosa PCR incluyen:
- Longitudes PCR de destino deben ser alrededor de 500bp pero rara vez excederá 1000bp
- Suponer aproximadamente 30 segundos de amplificación por 500bp
- Mantener primer avance y retroceso temperatura ±1 ° C de fusión si es posible
- Evitar dirigidos a regiones con la repetición de nucleótidos (poly-extensiones, es decir. AAAAA... o GCGCGCGC...)
- Evite poner sus primers en regiones con SNPs comunes
Puedes ver en la imagen para este paso que estoy usando Primer3 encontrar cartillas a la talasemia beta SNP para la secuencia. Usando programas como Primer3 primer diseño son una buena idea porque te dan combinaciones de cartilla con la termodinámica mejor (ver aquí las características de la cartilla). Entonces tienes que comprobar tus cartillas en e inversa-PCR (ver segunda imagen) para asegurarse de que son específicas para sólo la secuencia de destino. Para obtener más información en el diseño de una buena reacción de polimerización en cadena, haga clic en aquí.
