Paso 17: Avanzado análisis genético DIYBio: alineación y análisis de la secuencia
¿Así que su producto PCR y ahora quieren ver lo que dice?
Como un DIYbiologist puede ser difícil encontrar un núcleo centro de secuenciación de ADN, pero merece la pena hurgando su universidad local o buscar en internet para "servicios de secuenciación de ADN". Puede ser difícil encontrar un lugar que está dispuesto a tomar el ADN de personas independientes, especialmente aquellos que se purifican a través de métodos de "homebrew", así que esto es donde asociarse con un laboratorio local de DIYBio es probablemente mejor. En cualquier caso tendrá que enviar la facilidad de secuenciar su ADN junto con los primers (o secuencias de la cartilla) quiere les secuencia, puede utilizar sus primers PCR o diseñar primers "nested" adicionales dentro de su PCR amplicón a secuencia con (recomendado).
Una vez eres capaz de encontrar un centro de secuenciación y recibir los resultados de secuenciación que tendrá que analizarlas. Todavía tengo que encontrar la perfecta alineación de la secuencia libre y software de edición. Para la mayoría puede modificar o alinear resultados de secuenciación (cromatogramas), no tanto, y es un dolor real a editar cada cromatograma por separado y luego alinear el basecalls (formato de texto). Esto es donde los productos comerciales tienen la ventaja definitiva.
Las imágenes de arriba son los cromatogramas HBB que genera y la secuencia de referencia HBB en BioEdit, que permite muchas de las mismas funciones que los productos comerciales sin embargo sólo permite para alineamiento de pares. De UNIPRO UGENE también tiene buena pinta, pero yo no he utilizado. Alternativamente, podría editar y convertir todos los cromatogramas a archivos de texto y alinear usando un programa como Clustal o cualquier número de los programas en esta lista.
Una vez que usted carga sus cromatogramas querrá editar las secuencias para asegurarse de que el programa automatizado hecho las llamadas derecho base haciendo clic sobre la secuencia editable (segunda foto). Una vez que tengas todas las secuencias editadas puede alinear a su secuencia de conexión y resolver cualquier discrepancia o verificar nucleótidos heterozigóticos. También puede preparar la secuencia de referencia mostrando características (tercera y cuarta imagen) para que usted pueda ver los polimorfismos (variaciones, Quinta imagen) en la secuencia y, después de alinear, a ver si tu muestra tiene cualquier polimorfismos.
Para descargar la secuencia de referencia (ya sea para diseñar cebadores contra él de los pasos anteriores o para alinear en este paso) encontrar el gene que busca en la base de datos del Gene en el NCBI. Al hacer clic en el gen grabar Desplácese hacia abajo hasta la sección "Secuencias de Referencia NCBI (RefSeq)" y seleccione el vínculo 'GenBank' bajo la RefSeqGene 'Genómica'. Esto le llevará a la GenBank secuencia (sexta foto) donde se puede descargar la secuencia de referencia haciendo clic en el menú desplegable junto a 'Enviar' (cuadro VII).
